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Two-ligand screen assay: RAW 264.7

The two-ligand assays are carried out with the goal of identifying non-additive effects due to the interaction of multiple ligands. In all experiments, the effects of single ligand and simultaneous ligand addition are measured. Where practical, the effect of sequential ligand addition is also studied. Assays include immunoblots to detect phosphorylation at specific sites within a panel of signaling proteins, and time-dependent changes in concentrations of cyclic AMP and Ca2+. The ligand names in the first column of each table are linked to descriptions of the ligands and the table entries are linked to the data for that ligand-pair/assay combination. Ligand pairs are annotated as follows:

  • Y - ligand interaction observed for at least one phosphoprotein or cytokine
  • N - no interaction between ligands observed
  • i - incomplete data, conclusion not drawn
  • A - additive response to ligand pair, same as sum of single ligand responses: R(X+Y) = R(X) + R(Y)
  • >A - greater than additive response: R(X+Y) > R(X) + R(Y)
  • <A - less than additive response: R(X+Y) < R(X) + R(Y)

greenarrow Cytokine assay
greenarrow Ca2+ assay
greenarrow cAMP assay
greenarrow Phosphoprotein assay

Cytokine two-ligand screen assay: RAW 264.7
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  UDP TGF S1P PGE PAF P3C P2C MCF LPS LPA ISO IFG IFB IFA I1B I10 I06 I04 GMF C5A 848 2MA
2-Methyl-thio-ATP  Y Y N Y N Y N N Y N Y Y N Y N N Y Y N N N  
Resiquimod (R-848)   N Y N Y Y Y Y N Y N Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y    
Complement C5a  N Y Y Y Y Y N Y N N Y N N Y Y Y N Y Y      
Granulocyte macrophage colony stimulating factor  Y Y N N Y Y Y N Y N N Y N N N N Y N        
Interleukin-4  N Y N N N Y Y N Y N N N Y N N N N          
Interleukin-6  N Y N N Y Y Y Y Y Y N Y N Y N N            
Interleukin-10  N N N N N Y Y N Y N Y N N N N              
Interleukin-1-beta  N Y N N N N Y Y Y Y N Y N Y                
Interferon-alpha   N N N N N Y Y N N Y N Y N                  
Interferon-beta  N N N N N Y Y N Y N Y N                    
Interferon-gamma  N Y N Y N Y Y Y Y Y N                      
Isoproterenol  N Y N Y N Y Y N Y N                        
Lysophosphatidic acid  Y Y N Y Y Y Y N Y                          
Lipopolysaccharide  Y Y N Y N Y Y Y                            
Macrophage colony stimulating factor  N N N Y Y Y N                              
PAM2CSK4  Y Y Y Y N Y                                
PAM3CSK4  Y Y Y Y N                                  
Platelet Activating Factor  N N N Y                                    
Prostaglandin E2  Y N N                                      
Sphingosine-1-phosphate  N N                                        
Transforming growth factor-beta  N                                          
Uridine 5'-diphosphate                                             

Intracellular Ca2+ two-ligand screen assay
(both ligands elicit Ca++ response): RAW 264.7

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  UTP UDP PAF LPA C5A 2MA
2-Methyl-thio-ATP  <A A A A A  
Complement C5a  >A >A <A <A    
Lysophosphatidic acid  <A <A <A      
Platelet Activating Factor  <A <A        
Uridine 5'-diphosphate  <A          
Uridine 5'-triphosphate             

Intracellular Ca2+ two-ligand screen assay
(one ligand elicits Ca++ response): RAW 264.7

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  UTP UDP PAF LPA C5A 2MA
Resiquimod (R-848)   A A A <A A A
Granulocyte macrophage colony stimulating factor  A A A A A A
Interleukin-4  A A A A A >A
Interleukin-6  A A A A A A
Interleukin-10  A A A A A A
Interleukin-1-beta  A A A A A A
Interferon-alpha   A A A A A A
Interferon-beta  A A A A A A
Interferon-gamma  A A A <A A A
Isoproterenol  A A <A <A <A <A
Lipopolysaccharide  A A A A A A
Macrophage colony stimulating factor  A A A A A A
PAM2CSK4  A >A A <A A A
PAM3CSK4  A A A A A A
Prostaglandin E2  A A A <A <A A
Sphingosine-1-phosphate  >A >A A >A >A >A
Transforming growth factor-beta  A A A A A A

Intracellular cAMP two-ligand screen assay
(both ligands elicit cAMP response): RAW 264.7

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  PGE ISO
Isoproterenol  <A  
Prostaglandin E2     

Intracellular cAMP two-ligand screen assay
(one ligand elicits cAMP response): RAW 264.7

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  PGE ISO
2-Methyl-thio-ATP  >A/A >A/>A
Resiquimod (R-848)      
Complement C5a  A/A >A/A
Granulocyte macrophage colony stimulating factor  A/A A/A
Interleukin-4  >A/A  
Interleukin-6    A/A
Interleukin-10  A/A  
Interleukin-1-beta  A/A  
Interferon-alpha   A/A A/A
Interferon-beta  A/A A/A
Interferon-gamma  A/A A/A
Lysophosphatidic acid  >A/>A >A/>A
Lipopolysaccharide  A/A A/A
Macrophage colony stimulating factor     
PAM2CSK4    A/A
PAM3CSK4    A/A
Platelet Activating Factor  >A/A >A/>A
Sphingosine-1-phosphate  >A/A >A/>A
Transforming growth factor-beta  A/A  
Uridine 5'-diphosphate  >A/<A >A/A
Uridine 5'-triphosphate  >A/A >A/>A

Phosphoprotein two-ligand screen assay: RAW 264.7
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  UDP TGF S1P PGE PAF P3C P2C MCF LPS LPA ISO IFG IFB IFA I1B I10 I06 I04 GMF C5A 848 2MA
2-Methyl-thio-ATP  Y Y Y N Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y Y Y Y N Y Y  
Resiquimod (R-848)   Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y Y Y N N Y Y N N    
Complement C5a  N N Y N Y Y N N N Y N Y Y N N Y N Y N      
Granulocyte macrophage colony stimulating factor  Y Y N Y N Y Y N Y N Y Y N N N Y N N        
Interleukin-4  Y Y N Y Y N N N Y Y N Y N Y N Y N          
Interleukin-6  Y N Y N Y Y Y N Y Y N N Y Y Y Y            
Interleukin-10  Y Y N Y Y Y N N Y Y Y Y N N N              
Interleukin-1-beta  Y Y N Y Y Y Y N Y Y Y Y N N                
Interferon-alpha   Y N Y Y Y Y Y Y Y Y N Y Y                  
Interferon-beta  Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N N                    
Interferon-gamma  Y Y Y N Y Y Y Y Y Y N                      
Isoproterenol  Y N Y Y Y Y Y N Y Y                        
Lysophosphatidic acid  N i Y Y N Y Y Y Y                          
Lipopolysaccharide  Y Y Y N Y Y Y Y                            
Macrophage colony stimulating factor  Y Y Y N Y Y Y                              
PAM2CSK4  Y Y Y N Y Y                                
PAM3CSK4  Y N Y Y Y                                  
Platelet Activating Factor  Y Y Y Y                                    
Prostaglandin E2  Y N Y                                      
Sphingosine-1-phosphate  Y N                                        
Transforming growth factor-beta  Y                                          
Uridine 5'-diphosphate                                             

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